Das Verhältnis zwischen Itachi und Sasuke ist von Brüderlichkeit und Zuneigung geprägt.Doch mit der Zeit distanziert sich Itachi immer mehr, woraufhin Fugaku anfängt, Sasuke unter Leistungsdruck zu setzen, weswegen er auch anfängt, seinen Bruder als Konkurrenten zu betrachten.Als Itachi nach dem Fund von Shisuis Leiche Besuch von der Konoha-Polizei erhält und diese ihm mitteilen, dass er unter Mordverdacht steht, zweifelt Sasuke zum ersten Mal an seinem Bruder und als Itachi schließlich von Sasuke nach dem Massaker überrascht wird, sagt er, seine Zuneigung wäre immer nur vorgespiegelt gewesen und Sasuke solle lieber an dem Konkurrenzgedanken festhalten, was dessen weiteren Lebensweg sehr stark prägt.
Es ist allerdings nicht bekannt, warum Itachi seinen kleinen Bruder am Leben lässt.
Nachdem Sasuke sein Training bei Orochimaru beendet und wieder auf Itachi trifft, erfährt man, dass Itachi das ewige Mangekyō Sharingan besitzen will, um seiner unvermeidlichen Erblindung entgegenzuwirken, was sein Verhalten gegenüber Sasuke erklärt, der ja sein eigenes Mangekyō entwickeln sollte, um dann von Itachi getötet zu werden. Jedoch erweist sich Sasuke als zu stark und Itachi überlebt diese Konfrontation nicht.
Wiederum später erfährt man von Tobi, dass dies auch nur eine Finte von Itachi war und er erzählt die ganze Geschichte um die Verschwörung des Uchiha-Clans gegen den Hokage. Hierbei wird deutlich, dass Itachi immer nur seinen Bruder beschützen wollte und dafür sogar bereit war sein Leben zu opfern. Denn unter anderem war der Kampf gegen Sasuke nur ein Mittel zum Zweck um einerseits den Einfluss Orochimarus auf ihn zu brechen und ihm andererseits mit Tensha Fūin: Amaterasu das Mangekyō zu übertragen.
Als Sasuke jedoch gegen Danzō kämpft, taucht Itachi plötzlich auf. Ob es sich dabei wirklich um Itachi oder einem Genjutsu handelt, ist nicht bekannt.